通过构建猪肺部微生物基因和基因组集揭示猪肺炎支原体菌株引起猪肺部病变的机理

研究论文

● 原文: iMeta (IF 23.8)

● 原文链接: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/imt2.258

● DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.258

● 2024年12月26日，江西农业大学黄路生、陈从英和艾华水等在iMeta在线发表了题为“Comprehensive lung microbial gene and genome catalogs assist the mechanism survey of Mesomycoplasma hyopneumoniae strains causing pig lung lesions”的文章。

● 本研究使用大规模高深度宏基因组测序，构建了目前为止较为全面的猪下呼吸道微生物基因和基因组集，在此基础上揭示了猪肺炎支原体菌株及其粘附相关毒力因子与肺部病变的相关性，使用分离的猪肺炎支原体菌株与猪支气管上皮细胞共培养，证实不同菌株对肺部病变程度的差异性，并用菌株转录组测序解析其机理。通过猪肺炎支原体菌株和感染的猪支气管上皮细胞双转录组测序分析，阐明猪肺炎支原体菌株通过促进宿主气管上皮细胞免疫和炎症反应、氧化应激和细胞凋亡导致肺部病变的机理。研究结果对后续深入开展猪下呼吸道微生物组研究及探究其与肺部健康的关系提供了重要基础。

● 第一作者：李井泉、黄菲、周云燕

● 通讯作者：黄路生（lushenghuang@hotmail.com）、陈从英（chencongying@jxau.edu.cn）、 艾华水（aihsh@hotmail.com）

● 合作作者：黄涛、童信凯、张明鹏、谌佳琪、张洲、杜慧鹏、刘梓峰、周梦、夏侯翌雯

● 主要单位：江西农业大学猪遗传改良与种质创新全国重点实验室

 亮 点

●  使用5个不同猪群体，构建了目前为止较为全面的猪下呼吸道微生物基因集，该基因集包含10,031,593个非冗余基因，构建了356个非冗余的猪下呼吸道微生物宏基因组组装基因组（MAGs）；

●  利用有系统肺部病变表型测定实验猪群体，发现猪肺炎支原体菌株及其黏附相关的毒力因子与肺部病变之间的显著相关性，并在两个不同的猪群中得到了验证。通过猪肺炎支原体菌株体外感染猪支气管上皮细胞实验，证实猪肺炎支原体菌株对肺部细胞的黏附和损伤；

●  发现猪肺炎支原体黏附激活了宿主细胞多个信号通路，包括核因子κB轻链增强子（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、细胞凋亡以及活性氧（ROS）反应，导致纤毛丧失、上皮细胞间屏障破坏及肺组织损伤。

摘  要

了解猪下呼吸道微生物群落结构对于阐明其在呼吸道疾病中的作用至关重要。然而，由于从健康和患病个体下呼吸道获取微生物样本的困难，致使这方面的研究很少。本研究利用675头有详细肺部病变表型记录猪的744份下呼吸道微生物样本，进行高深度宏基因组测序，构建了一个迄今为止规模最大的包含10,031,593个非冗余基因的猪肺部微生物基因集，该基因集中44.8%的基因为新基因。本研究还构建了356个宏基因组组装基因组（MAGs），这些MAGs进一步聚类为256个物种水平的基因组分箱（SGBs），其中41.8%SGBs为首次报道。基于构建的基因和基因组集，并通过分离相关菌株，使用体外感染和RNA测序，发现并证实了猪肺炎支原体MAG_47菌株及其黏附相关毒力因子（VFs）与猪肺部病变相关。黏附和免疫调节相关VFs的差异表达导致了猪肺炎支原体菌株间对宿主细胞黏附和致病性的异质性。猪肺炎支原体黏附激活了核因子κB轻链增强子（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、细胞凋亡、辅助性T细胞1（Th1）和辅助性T细胞2（Th2）分化、肿瘤坏死因子（TNF）信号、白细胞介素-6（IL6）/janus激酶2（JAK2）/信号转导和转录激活因子（STAT3）信号、活性氧（ROS）反应等通路，导致肺部支气管上皮纤毛丢失、上皮细胞-细胞屏障破坏和肺组织病变。我们还比较了感染肺炎支原体人和感染猪肺炎支原体猪之间的肺部微生物组成差异性。研究结果对后续深入开展猪下呼吸道微生物组研究及探究其与肺部健康的关系提供了重要基础。

引  言

呼吸系统疾病是生猪生产中最为重要的健康问题之一，它影响猪的生长和饲料转化效率，并造成重大的经济损失。猪呼吸系统疾病的诊断非常具有挑战性，需要结合肺部病变评估。猪的呼吸系统疾病是多因素导致的，通常是病原体和环境因素相互作用的结果，涉及通风、生产系统和管理方法等。在过去的几年里，越来越多的证据表明，肺部微生物组对呼吸系统疾病有着重要的影响。因此，揭示肺部微生物组的群落结构，解释其在维持肺部健康和相关疾病中的作用至关重要。

虽然肺部菌群的多样性和丰度远低于口腔和肠道菌群，但不依赖于培养的技术，如16S rRNA基因测序分析，已证明肺部菌群的多样性和高度个体特异性。鸟枪法宏基因组测序的应用使得从菌株水平推断微生物群落的功能能力和探索与肺部疾病相关的微生物种类成为可能。目前，宏基因组测序已用于建立呼吸道微生物基因集，并用于诊断人类肺部疾病和呼吸道感染。然而，由于从患者采集支气管肺泡灌洗液（BAL）样本非常困难，因此缺乏来自广泛样本来源的全面的呼吸道微生物组基因/基因组集。据我们所知，目前尚缺乏物种水平的猪肺微生物群落组成和功能的系统研究。这严重限制了宏基因组测序技术在猪下呼吸道微生物群落分析和呼吸系统疾病诊断中的应用。此外，有几项研究显示，猪肺炎支原体是猪慢性呼吸系统疾病（地方性肺炎）的主要致病因子之一。然而，猪肺炎支原体致病的明确机制尚不清楚。几项人类中的研究也表明，肺炎支原体是与人类急性呼吸道感染相关的主要细菌病原体之一。考虑到人类和猪的肺在解剖结构上的高度相似性，在感染肺炎支原体或患有炎症性肺疾病的个体中，人类和猪的肺部微生物组成和潜在功能能力是否相似尚不清楚。

在本研究中，实验猪屠宰后立即从猪肺中获取微生物样本，有效避免来自口腔和上呼吸道的污染，我们对5个猪品种的744个下呼吸道微生物样本进行了宏基因组测序。构建了包含10,031,593个基因的猪下呼吸道微生物基因集（PRGC），并通过binning分析获得了356个宏基因组组装基因组（MAGs）。基于此，本研究对猪下呼吸道微生物群落结构进行了高分辨率表征，证实了猪肺炎支原体菌株在肺部病变中的作用，并通过支气管上皮细胞体外感染实验和基因表达分析，探讨了猪肺炎支原体菌株引起肺部病变的机制。

结  果

猪下呼吸道微生物基因集的构建

实验猪屠宰后30分钟内收集下呼吸道微生物样品，共收集到来自5个具有广泛代表性猪群675头猪的670份BAL样本和74份气管灌洗样本（见方法）（表S1、S2）。鸟枪法宏基因组测序获得了平均每个样本70.30 Gbp的原始测序数据（图S1A）。在进行质量控制并去除宿主DNA污染后，获得了平均每个样本1.52 Gbp的有效序列用于后续分析（图S1B）。我们使用6个用于灌洗的磷酸盐缓冲液（PBS）作为空白样本和6个用于建库测序的混合试剂作为测序背景对照样本进行了宏基因组测序（见方法）。在相同的测序条件下，这些对照样本获得的测序数据量显著较少（原始数据量为28.4 ~ 473.2 Mb）（图S1C）。对照样品中鉴定出的丰度排名前10的细菌，其总丰度占所有对照样品中鉴定到的总微生物丰度的97.9%。然而，这10个物种中只有3个在744个实验样本中被鉴定到（表S3）。此外，在实验样本中，它们的总相对丰度平均为0.02%（范围为0 ~ 1.2%）（表S4）。这表明污染不太可能对实验样品中的微生物组产生实质性影响。

采用了单样本组装和所有测序样本共组装相结合的组装策略，共获得19,365,625个长度≥500 bp的contigs。平均每个样本中有超过81.2%的clean reads可以mapping到这些contigs上。以ORF>100 bp为阈值对所有从contigs中预测的基因进行筛选。在Prodigal预测中，具有完整开放阅读框（ORF）的基因即使长度小于100 bp也被保留。将所有基因按氨基酸序列同源性分别为100.0%、90.0%和50.0%进行聚类，构建一个非冗余基因集，得到基因集PRGC100、PRGC90和PRGC50。我们进一步过滤掉了那些注释为真核生物的基因，但作为下呼吸道微生态系统的重要成员，分类为真菌和原生生物的基因被保留下来。三个基因集中的基因数量分别为12,731,136（PRGC100）、10,031,93（PRGC90）和5,677,557（PRGC50）（图1A）。与PRGC100相比，PRGC90和PRGC50中注释蛋白的数量分别减少21.0%和55.0%。然而，在PRGC90中，鉴定的物种分类群数量只减少了1.0%（图1A），而在PRGC50中减少了13.0%，表明在90.0%氨基酸序列一致性阈值下，被去除的基因主要是冗余的基因。去冗余不会显著影响鉴定的微生物分类数量。因此，我们使用PRGC90基因集进行后步分析。

基于PRGC90的稀疏曲线显示，当样本数≥200时，基因数量趋于饱和（图1B）。与PRGC90的10,031,593个基因相比，饱和状态下的基因数量超过600万个。这一发现表明，共组装策略可以确保获得许多因丰度低而无法在单个样本中组装的基因。在测序深度不足的情况下，这种情况是可以理解的。然后，我们在744个样本中分析了PRGC90中预测基因的流行率。至少1份样本中存在的基因数为6,398,682个（63.8%）。有810,747个（8.1%）基因存在于>20.0%的样本中，而只有40,040个（0.4%）基因存在于>90.0%的样本中（图1C）。此外，我们进一步分析了至少一个样本中存在的640万个基因的相对丰度，发现这些基因大多表现为低丰度。只有1,079,287个基因的丰度大于平均丰度（图1D）。这些结果表明猪下呼吸道菌群中微生物基因组成具有高度的多样性和异质性。

通过将PRGC90中的基因映射到UniProt TrEMBL数据库，确定猪下呼吸道微生物组的系统发育组成。共3,179,743个（31.7%）基因可进行分类注释。这些基因被划分到4个界、81个门、1018个属和1570个物种。1570个微生物种中，细菌有1429个种。在门水平，猪下呼吸道菌群优势菌门为变形菌门（44.0%）、软壁菌门（31.0%）、厚壁菌门（10.0%）、拟杆菌门（6.0%）和放线菌门（4.0%）。共鉴定出病毒分类中的11个门、124个属和63个物种。在这些病毒中，Ungulate tetraparvovirus 2的丰度最高（图S2A）。鉴定到4个真菌门、38个属和21个物种。Pneumocystis jirovecii是优势真菌种类（图S2B）。我们还鉴定到3个古菌门、9个属和9个物种。其中，Methanobrevibacter smithii为优势古菌种（图S2C）。此外，我们还在门、属和种水平分析了这些物种分类在744份测试样本中的流行情况。在超过90.0%的样本中检测到的门有21个（占鉴定出的所有菌门的28.0%）（图1E）。相比之下，在>90.0%的样本中检测到的属只有188个（18.0%）、微生物种75个（5.0%），进一步表明猪下呼吸道微生物组成存在异质性。值得注意的是，大部分的微生物类群（>97.0%的物种）是细菌。病毒、真菌和古菌物种仅占总丰度的0.6%（图S2D），因此在后续分析中，我们仅关注细菌。

通过将PRGC90中的基因注释到碳水化合物活性酶（CAZyme）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因进化谱系：非监督同源组（eggNOG）数据库，注释猪下呼吸道微生物组的潜在功能。共有154,154个基因注释到594个独特的CAZy家族，3,078,547个基因注释到458个KEGG通路，4,362,614个基因注释到75,059个eggNOG同源物（表S5）。与微生物分类的流行率相似，26.0%的CAZy家族、18.0%的KEGG同源物、67.0%的KEGG通路和4.0%的eggNOG同源物存在于超过90.0%的检测样本中（图1F）。猪下呼吸道菌群共享功能比例较低，表明其功能存在异质性。

猪下呼吸道微生物MAGs的构建

由于下呼吸道微生物样本中宿主DNA污染的比例较高，因此少有研究能够从下呼吸道微生物宏基因组测序数据中成功重建微生物基因组。本研究采用单样本组装和联合组装生成的contig序列，通过宏基因组分箱（binning）方法重建了1965个完整度≥50.0%、污染度≤10.0%的宏基因组组装基因组（MAGs）。这1965个MAGs依据99.0%的平均核苷酸相似性（ANI）被聚类为356个非冗余MAGs（表S6）。在这356个MAGs中，260个属于中等质量（即完整度至少为50.0%，污染度低于10.0%），其中194个MAGs的质量评分（QS）≥50（QS = 完整度 – 5 × 污染度），另外一个MAG的完整度≥90.0%但污染度>5.0%。剩余的96个MAGs为接近完整的基因组（完整度≥90.0%、污染度≤5.0%）（见图S3），其中19个MAGs符合基因组标准联盟（Genomic Standards Consortium, GSC）规定的“高质量”MAGs标准，即包含5S、16S、23S rRNA基因以及至少18个tRNA。流行病学分析显示，大多数MAGs在744个宏基因组测序样本中的检出率较低，仅有8个MAGs在超过90.0%的样本中出现，170个MAGs在至少20.0%的样本中检出，这进一步表明猪下呼吸道微生物组在不同样本之间具有较高的异质性。当然，样本间的测序深度差异以及MAG重建过程中组装的复杂性可能对结果产生一定影响。

所有356个非冗余的MAGs均使用GTDB-Tk进行了物种分类注释。其中，355个MAGs被分类注释为细菌，涵盖15个门，另一个MAG被注释为Methanobrevibacter A sp900769095（Methanobacteriota），一种产甲烷古菌。约58.2%（207个）MAGs能够被分配到149个独特的物种（图2A、B）。MAGs的最大数量（120个）归属于变形菌门，其次是拟杆菌门（81个）和厚壁菌门（46个）。为了揭示这些MAGs的系统发育关系，基于400个通用标记基因，通过PhyloPhlAn构建了356个MAGs的最大似然系统发育树（图2C）。属于变形菌门的MAGs在系统发育树中广泛分布，表明其具有较高的系统发育多样性。

所有356个MAGs进一步根据95.0%的ANI阈值聚类为256个物种水平基因组簇（SGBs）。在这256个SGBs中，41.8%（107个）未能与GTDB-Tk数据库中的任何现有基因组匹配，因此被定义为未知SGBs（uSGBs）（图2B）。其中，属于变形菌门、拟杆菌门和Firmicutes_A的SGBs数量分别为84、66和31个。注释为Thermus scotoductus、Acinetobacter johnsonii和M. hyopneumoniae的SGBs包含了最多的MAGs，分别为18、17和7个。所有107个uSGBs均可在目（order）水平上进行分类，且80.0%能够在属（genus）水平上进行注释，这表明相当一部分uSGBs可能是尚未描述的细菌物种。

通过整合微生物基因和基因组集来鉴定毒力因子基因（VFG）及其宿主细菌

通过对毒力因子数据库（VFDB）进行BLAST比对，在PRGC90中识别出了778,009个编码毒力因子（VFs）的开放阅读框（ORFs）。这些ORFs可被归类为17,144个毒力因子基因（VFGs），涵盖1162种毒力因子类型（如P97和溶血素）以及14个功能性致病因子类别（如黏附性和外毒素）。这17,144个VFGs的主要功能类别包括免疫调节（占总数的20.3%）、效应物质输送系统（15.8%）、营养/代谢因子（15.5%）、黏附性（12.8%）和运动性（12.3%）（表S7）。我们进一步将VFGs的序列与UniProt TrEMBL数据库进行比对，以识别其潜在的宿主细菌。在属水平上，17,144个VFGs广泛分布于559个细菌属，涵盖30个细菌门，尤其在铜绿假单胞菌和不动杆菌中表现突出。在物种水平上，识别出了639种宿主细菌物种（表S8）。图S4展示了宿主物种中携带VFGs数量排名前50的分类分布。Moraxella osloensis携带了最多的VFGs（3014个）。此外，我们还对VFGs在MAGs中的分布进行了深入分析。在356个MAGs中，共鉴定出10,845个VFGs，其中MAG_155包含最多的VFGs（1028个），该MAG被注释为Mesorhizobium。

两个呼吸道部位和五个猪群体之间下呼吸道微生物组中的核心微生物物种比较

本研究共有69头猪都采集了气管和支气管肺泡灌洗液（BAL）样本，可以用以比较气管和BAL样本中的微生物组成。气管样本的微生物组成在观察到的物种指数（α多样性）上表现出较高的多样性，尽管Shannon指数的差异未达到显著水平（图S5A）。基于Bray-Curtis距离和主坐标分析（PCoA），气管样本的β多样性显著高于BAL样本（p = 9.3 × 10??）（图S5B）。在物种水平上，分别在气管和BAL液体样本中识别出了七种核心物种，这些物种的相对丰度位列前20名（图S5C）。

随后，我们探讨了肺部微生物群核心物种在本研究中所用的五个猪群体中的分布情况。在每个群体>95.0%的个体中均能检测到的物种定义为核心微生物种。分别在F7、巴克夏×里岔、藏猪、二花脸猪和野猪中鉴别到65、70、74、75和116种核心物种。我们重点分析了每个群体中丰度排名前20的核心物种。M. hyopneumoniae、Moraxella osloensis、Prevotella copri、Escherichia coli 和 Glaesserella parasuis在所有五个群体中的丰度都排名前20的核心物种。中国地方猪种二花脸猪（五种物种）、藏猪（七种物种）和野猪（八种物种）拥有更多的群体特异性核心物种（图S6）。

鉴定与肺部病变相关的微生物分类和潜在功能

本研究对613头F7猪的BAL样本进行了分析，旨在探讨肺部病变与肺微生物群之间的关系。所有实验猪均在相同的猪场环境下饲养，使用相同的商业饲料，以减少环境因素的干扰，从而提供更有力的证据来分析肺微生物群与肺部病变之间的关系。根据肺部病变评分，研究对象被分为四组：健康肺组（HL，n = 51）、轻度肺部病变组（SLL，n = 217）、中度肺部病变组（MLL，n = 218）和重度肺部病变组（SVLL，n = 127）（详见方法部分）。我们首先对这四组的肺微生物群α多样性和β多样性进行了比较。结果显示，HL组的α多样性最高，基于Shannon指数和观察物种数指标，且随着肺部病变程度的加重（从SLL到SVLL），α多样性显著下降（图4A）。β多样性方面，四组之间的差异显著，肺部微生物群组成的相异性随着肺部病变的加剧而增大（图4B）。因此，四组间微生物群多样性的变化表明，肺微生物群与肺部病变之间存在一定的关联。

我们进一步鉴定了与肺部病变相关的微生物物种。共识别出27种在四组猪群中具有显著丰度差异的细菌物种（图4C）。随着肺部病变程度的加重，猪肺炎支原体和猪鼻支原体（Mesomycoplasma hyorhinis）的相对丰度显著增加（图S7A）。特别是，猪肺炎支原体与肺部病变的关联最为显著（LDA = 5.1，p = 1.3 × 10^-6；图4C）。我们进一步构建了一个共现性网络，以确定上述27个差异物种之间的相互作用关系（图4D）。总体来看，共现性网络可以明显划分为两个子模块。一个子模块仅包含猪肺炎支原体和猪鼻支原体，并且在HL、SLL和MLL组中与其他25个差异丰度物种的连接较少（仅在HL组中存在少数正向相互作用），而另一个子模块中的25个差异丰度物种则与彼此呈现显著的正相关关系。我们观察到四组猪之间相互作用网络的两个显著特征：1）HL组中27种差异细菌物种之间的连接显著少于其他三组（每个节点的平均连接边数：8.6 vs. 13.9，p<0.01），提示健康猪中细菌物种之间的相互作用较少；2）在严重肺部病变组（SVLL组）中，两个Mesomycoplasma物种与其他子模块中14种差异物种之间检测到了显著的负向相互作用（图4D）。基于两个Mesomycoplasma物种与肺部病变的最显著关联、α多样性下降和相互作用网络分析（图4，S7A），我们推测，Mesomycoplasma物种，特别是猪肺炎支原体的过度丰度可能会减少其他非 Mesomycoplasma物种的多样性，而猪肺炎支原体是与猪肺部病变密切相关的关键物种。

在本研究中，我们通过构建猪下呼吸道微生物组的MAGs，识别出了与肺部病变相关的细菌菌株。我们重点关注了属于猪肺炎支原体和猪鼻支原体的MAGs。在非冗余356个的MAGs中，猪肺炎支原体包含7个不同的菌株MAGs。除MAG_2（图S7B）外，其余六个猪肺炎支原体MAGs与肺部病变显著相关。与HL组相比，SVLL组和MLL组中这六个MAGs的丰度显著增加（p = 2.6 × 10?3 ~ 1.8 × 10??）（图4E）。不同的显著性水平提示这些猪肺炎支原体MAGs可能在致病性上存在差异。MAG_47的关联最为显著，且其丰度随着肺部病变的严重程度增加而增加（图4E）。值得注意的是，MAG_2的低流行率（仅为10.0%）可能是其未能达到显著性关联的原因。此外，研究中仅识别到一猪鼻支原体MAG，并且该MAG在SVLL组的猪中显著富集（图S7C）。

我们进一步检验了是否存在其他病原体导致实验猪出现肺部病变。鉴于宏基因组测序数据能够通过序列比对识别细菌病原体和DNA病毒，我们从NCBI Refseq数据库下载了242个完整基因组，涵盖了以前已报道与猪肺部疾病相关的病原体，包括Actinobacillus pleuropneumoniae（胸膜肺炎巴氏菌）、Bordetella bronchiseptica（博德氏分枝杆菌）、Porcine circovirus（猪圆环病毒）和Suid alphaherpesvirus 1（猪α疱疹病毒1型）。将宏基因组测序的序列与这些病原体基因组进行比对，结果显示在实验猪的下呼吸道中未发现这些病原体的感染证据。鉴于猪繁殖与呼吸综合症病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV，）也可引起肺部疾病和损伤，我们进一步检测了F7组猪只的PRRSV抗体水平。结果显示，几乎所有检测的猪只（99.2%）均为PRRSV抗体阳性。然而，在对HL组、SLL组、MLL组和SVLL组猪只之间的PRRSV抗体浓度进行比较时，未发现各组之间的抗体水平存在显著差异（p = 0.16）。这一结果表明，PRRSV抗体的阳性反应应与PRRSV疫苗接种相关（见方法）。此外，所有F7组实验猪的饲养记录都非常详细，且没有任何关于繁殖与呼吸综合症的疾病记录。因此，这些结果表明，肺部病变并非由其他病原体的感染引起。

为了进一步确认猪肺炎支原体菌株在不同猪群体中肺部病变发生中的作用，我们在另一群体（巴克夏×里岔猪）中进行了关联分析，该群体包含11只健康猪和17只有肺部病变的猪（方法详见）。有趣的是，只有两种支原体属物种在肺部病变猪中显著富集，其中猪肺炎支原体与肺部病变的关联最为显著（LDA = 5.2，p = 3.0 × 10?3）。此外，在健康猪中富集的19种细菌物种中，有8种在F7群体中也被检测到（图S7D）。在猪肺炎支原体的七个MAGs中，有六个与肺部病变显著相关，p值范围从0.029到9.10 × 10??（图S7E）。同样，MAG_47表现出最显著的关联（p = 9.10 × 10??）。所有这些结果进一步证实了猪肺炎支原体菌株与猪肺部病变之间的显著关联。令人费解的是，猪鼻支原体及其MAGs与肺部病变的关联在巴克夏×里岔猪群体中未达到统计学显著性（图S7F）。

VFs在猪肺炎支原体感染和致病过程中发挥着重要作用。我们进一步研究了下呼吸道微生物组中VFs与肺部病变严重程度的关联。在F7群体中共识别出28种与肺部病变相关的VF类型（图S9A）。这28种VF类型中，有16种在SVLL组中显著富集，包括P97/P102 paralog family、P146、P102、P65、P159和P216，这些都已知是参与猪肺炎支原体附着于宿主呼吸道纤毛上皮细胞的粘附素。P97/P102 paralog family表现出最显著的关联（LDA = 3.8，p = 1.7 × 10??）（图S9A）。此外，有9种VF类型在HL组中显著富集。这9种VF类型的宿主细菌物种与SVLL组中的两种支原体属下的细菌呈负相关（图4D和表S9），这提示在HL组中VF类型的富集可能是由于宿主细菌物种的高丰度所导致。

在巴克夏×里岔猪中识别出的肺部病变相关VF类型与F7群体中检测到的高度相似（图S9B）。P97/P102 paralog family、P102、P65、P146、P159和P216在有肺部病变的猪中显著富集，其中P97/P102 paralog family具有最显著的关联。这些结果强烈表明，猪肺炎支原体菌株通过VFs介导的对宿主呼吸道纤毛上皮细胞的附着可能在肺部病变的发生中发挥着至关重要的作用。

猪肺炎支原体株泛基因组与毒力因子分布

本研究中构建的1965个MAGs（在去重之前），其中获得的最大数量的MAGs来自猪肺炎支原体（n = 262）。用于系统发育和泛基因组分析的猪肺炎支原体基因组共291个，包括262个本研究中构建的MAGs、来自不同猪群体的6个分离株基因组，以及从NCBI RefSeq数据库下载的23个猪肺炎支原体基因组（见表S10）。通过基于393个核心基因（在>95.0%的基因组中存在）进行的贝叶斯聚类分析，共获得了9个亚分支。所有23个从NCBI RefSeq数据库下载的猪肺炎支原体基因组均聚类到9个亚分支中的5个，并且它们与本研究中重构的MAGs相比，表现出较高的遗传相似性（较小的NMD距离）（图5A）。重构得到的MAGs分布于5个亚分支，这些亚分支表现出较大的遗传距离。通过基于393个核心基因的多重序列比对构建的最大似然系统发育树显示，公共数据库中的基因组分布在一个有限的系统发育空间内，而MAGs则呈现出较为广泛的系统发育结构（图5B）。因此，重建的MAGs大大扩展了猪肺炎支原体基因组的遗传多样性。

除了393个核心基因外，通过Roary软件从291个猪肺炎支原体基因组中共获得了3136个泛基因。其中，2373个基因（占76.0%）仅在不到44个（15.0%）基因组中被检测到，表明这些基因具有菌株特异性。猪肺炎支原体基因组中的泛基因数量未表现出趋于饱和的趋势，提示该基因库仍可不断扩展（见图5C）。重构的MAGs具有比从数据库下载的基因组更为庞大的泛基因集合，进一步表明本研究中猪肺炎支原体菌株的遗传多样性得到了扩展。基于同源基因簇（COGs）和KEGG通路的注释分析发现，泛基因与核心基因在功能类别上没有显著差异（图S10）。

我们接着关注了不同猪肺炎支原体菌株中VF类型的分布，使用了七个非冗余的猪肺炎支原体MAGs和10个完整的猪肺炎支原体菌株基因组。由于两个猪肺炎支原体MAGs的完整度低于90.0%，最终共有15个基因组被纳入分析。如图5D所示，这15个菌株中共鉴定出71种不同的VF类型。菌株之间在VF类型组成上没有显著差异。几乎所有15个基因组都携带大量编码粘附素及相关粘附蛋白（如P97/P102 paralog family和纤维连接蛋白结合蛋白）、ABC transporter, and capsule蛋白的VFGs（图5D）。为了进一步比较不同菌株中这些VFG的转录水平，选择了两株猪肺炎支原体菌株进行RNA测序分析，其中一株为MAG47_like，与肺部病变相关的猪肺炎支原体MAGs相近，另一株为168L，远离与肺部病变相关的MAGs，在全基因组序列构建的系统发育树中表现出较大的差异（图5E）。有趣的是，与168L菌株相比，MAG47_like菌株表达了较高水平的编码粘附素和相关粘附蛋白的VFGs，包括P97/P102 paralog family、P102、P97、LppT和Lppt，但在pdhB、pdhA、pdhD-1和EF-Tu的表达水平较低，这些基因编码的蛋白质可结合补体因子H（complement factor H），从而抑制宿主补体通路中相关的免疫逃逸（图5F）。这一结果表明，MAG47_like菌株可能比168L菌株更强烈地粘附于宿主的支气管纤毛上皮细胞。综上所述，尽管不同猪肺炎支原体菌株的泛基因组和VFs组成没有显著差异，但粘附性和免疫调节相关VFGs的差异表达可能在决定猪肺炎支原体菌株的粘附能力和致病性方面起着重要作用。

通过体外感染猪支气管纤毛上皮细胞及基因表达分析探讨猪肺炎支原体引起猪肺部病变的机制

为了探究猪肺炎支原体不同菌株在猪肺病变和中的作用，实验选取了35日龄的大白猪，从其支气管中分离获得初代猪支气管上皮细胞（BECs）。在气?液界面培养体系下培养15天，待BECs发育成成熟的纤毛和多层结构后，分别从上述两株选定的猪肺炎支原体菌株（MAG47_like和168L）进行体外感染实验。感染后24小时，通过免疫荧光染色和定量实时PCR（qPCR）检测附着于BECs上的猪肺炎支原体数量。结果显示（图6A、B），两株菌株均能附着于BEC纤毛上。与168L菌株相比，MAG47_like菌株（与引起肺病变的猪肺炎支原体MAGs最为接近）在BEC纤毛上附着的细菌数量更多，尽管qPCR分析结果显示差异不显著（p = 0.26，图6C），但确认了与肺病变相关的猪肺炎支原体菌株在BEC纤毛上的附着能力存在差异。在猪肺炎支原体感染的BECs中观察到纤毛损伤。与MAG47_like菌株感染的BECs（大多数纤毛丧失）相比，168L菌株感染的BECs损伤的纤毛数量明显较少（图6D）。此外，跨上皮电阻（TEER）实验显示上皮细胞?细胞屏障受到了显著破坏（图6E）。与168L菌株感染的BECs相比，MAG47_like菌株感染的BECs显示出明显较低的TEER值（p = 4.6 × 10?3），提示MAG47_like菌株对上皮细胞?细胞屏障的破坏更为严重。

为了进一步阐明猪肺炎支原体菌株如何附着于支气管上皮细胞（BECs）纤毛上，导致纤毛丧失并进一步引起肺部病变，本文对四个未感染的BEC样本（作为对照组）、四个MAG47_like株与感染BECs的混合样本、以及五个168L株与感染BECs的混合样本在24小时后进行RNA测序分析。测得的有效数据量分别为：BEC对照组平均14.5 Gb（范围11.8至19.0 Gb），MAG47_like感染BEC组平均21.0 Gb（范围20.6至21.2 Gb），168L感染BEC组平均21.2 Gb（范围21.1至21.2 Gb），MAG47_like株为343.1 Mb（范围120.7至676.4 Mb），168L株为215.5 Mb（范围128.7至331.3 Mb）。对比了感染细胞与对照组之间以及MAG47_like与168L之间的差异表达基因（DEGs）。我们首先关注MAG47_like与168L之间在24小时后的差异表达基因，因为它们在附着和纤毛损伤方面表现出差异（如上所述）。与168L相比，MAG47_like株有179个基因的表达水平较高，而200个基因的表达水平较低（图S11和表S11）。编码附着素和附着相关蛋白的基因（如P97/P102 paralog family、P97、P102和P159）、与猪肺炎支原体表面展示的与宿主细胞免疫逃逸相关的蛋白（如PdhA、PdhB、PdhC和GAPDH），以及与蛋白分泌相关的蛋白（如Sec D和Sec G）在MAG47_like中表达水平明显高于168L（图S11A）。这表明MAG47_like在感染BEC时具有比168L更强的附着和免疫逃逸能力，与在BEC纤毛上观察到的更多MAG47_like细菌附着以及MAG47_like菌株较强的致病性一致。值得注意的是，与纯培养相比，两种菌株在感染BECs时，编码附着相关蛋白的基因在24小时后显著下调。然而，只有在168L株中，编码免疫逃逸相关蛋白的基因在感染BEC后才显著下调（图S11B，C）。

BECs的基因表达在24 h发生显著变化。在倍数变化≥2且错误发现率（FDR）<0.05的显著性阈值下，在对照细胞和MAG47_like和168L感染的BECs之间，分别识别出12,787和11,388个DEGs（表S12）。正如我们预期的那样，DEGs显著富集了NF-κB、MAPK、细胞凋亡、Th1和Th2细胞分化、TNF信号通路、IL6/JAK2/STAT3信号通路和对活性氧（ROS）通路，这些通路已被报道与猪肺炎支原体感染引起的细胞损伤相关（表S13）。例如，参与刺激NF-κB活性的MAP3K14、MAP3K8和NFKB1，以及与细胞凋亡和细胞死亡相关的FOS、SOCS3、IRF1、FLNC、HLA-DRA和PMAIP1，在猪肺炎支原体感染后上调（图6F）。值得注意的是，猪肺炎支原体感染也上调NFKBIA和CHUK（抑制NF-κB通路）、SELENOK（在保护细胞免受内质网应激诱导的凋亡中起作用）以及BIRC2和BCL2（阻断凋亡）（图6F）。之前的研究表明，猪肺炎支原体感染可以抑制NF-κB通路，促进感染细胞的存活。这种抗凋亡作用可能允许细菌在感染初期黏附和定植宿主BECs，随后引起更严重的促凋亡作用，导致组织损伤。猪肺炎支原体感染显著增加了JAK2和IL6（与免疫反应和炎症相关）、SOD2（与氧化应激相关）以及GADD45A和GADD45B（参与NF-κB、MAPK和凋亡通路，与氧化应激相关）的表达水平（图6F）。这些基因表达结果提示，猪肺炎支原体感染促进了宿主BECs的免疫炎症反应、氧化应激和凋亡，导致细胞死亡（纤毛丢失）和肺组织病变。有趣的是，与168l感染的BECs相比，MAG47_like感染细胞的FOS、SOCS3、MAP3K14、CD74、GADD45A和IRF1的表达水平较高，但NFKBIA（抑制NF-κB）、SOD2（降低促氧化和ROS水平）和KLF2（维持上皮完整性）的表达水平较低（图6F），提示MAG47_like株感染细胞具有更强的免疫和炎症反应、氧化应激和细胞凋亡。这一发现与MAG47_like菌株感染引起的更严重的纤毛损伤和上皮细胞-细胞屏障破坏相一致。

总之，猪肺炎支原体感染通过增加免疫炎症反应、氧化应激和细胞凋亡相关基因的表达水平，破坏BECs纤毛，破坏上皮细胞-细胞屏障。猪肺炎支原体菌株间黏附能力和致病性的差异可能是由于黏附和免疫逃避相关细菌基因表达水平的差异，导致宿主炎症反应、氧化应激和细胞凋亡相关基因表达水平的差异所致。

肺炎支原体肺炎患者与猪肺炎支原体感染猪肺部微生物组系统发育组成的比较

由于人类肺炎支原体感染相关肺疾病和猪肺炎支原体感染相关肺疾病的症状相似，我们首先对肺炎支原体和猪肺炎支原体这两个物种进行了比较基因组分析。该分析基于从NCBI RefSeq数据库下载的79个肺炎支原体的完整基因组和本研究中使用的17个猪肺炎支原体的完整基因组。结果显示，肺炎支原体和猪肺炎支原体的基因组之间有高度不同的遗传距离（图S12A）。利用TimeTree进行的系统发育进化分析显示，肺炎支原体和猪肺炎支原体在约1.574亿年前（置信区间：1.5000 - 1.648亿年前）发生分化。本文进一步研究了肺炎支原体和猪肺炎支原体基因组中VF类型和KOs的分布（图S12B，C）。在肺炎支原体和猪肺炎支原体基因组中均鉴定出大量VF类型（分别为54个和72个VF类型）。尽管在VF类型上有明显的差异，但在猪肺炎支原体和肺炎支原体基因组中均发现了与病原体黏附宿主细胞相关的VF，如P97/P102 paralog family。两种物种共享293个KOs（图S12D），这些共享的KOs富集在与核糖体、氨酰基- tRNA生物合成和碳代谢相关的通路（图S12E）。此外，与细菌致病性相关的蛋白输出和细菌分泌系统两条通路也在共享的KOs中富集。这些结果表明，虽然肺炎支原体和猪肺炎支原体分别是猪和人的不同病原体，但它们在引起肺部疾病方面可能具有相似的致病机制。

然后，我们利用本研究中产生的宏基因组数据和46个公开的肺炎支原体肺炎患儿BAL宏基因组测序数据，比较了感染肺炎支原体的人类和感染猪肺炎支原体的猪之间肺微生物组的系统发育组成和潜在功能。在门水平，在人肺微生物组中发现的所有15个门分类都包括在猪肺微生物组中检测到的门分类中，两者均有以下4个优势门（它们的相对丰度位于前5位）：变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和软壁菌门（图S13A）。在物种水平上，人类宏基因组数据中共鉴定出90种细菌。其中65个物种也存在于猪宏基因组数据中（72.2%）（图S13B）。在人类和猪数据集相对丰度排名前20的物种中，9种细菌是在两个数据集中共享的（图S13C）。在功能能力水平上，几乎所有在人肺微生物组中发现的KEGG通路（309/310）也在猪肺微生物组中被检测到（图S13D）。7条KEGG通路在人和猪肺微生物组中均具有较高的丰度（位于前20位）（图S13E）。所有这些结果表明，人肺炎支原体感染肺炎患者的肺部微生物组组成与猪肺炎支原体引起的肺部病变猪的高度相似。

讨  论

为了系统地研究猪呼吸道微生物组在呼吸系统疾病中的作用，我们对猪下呼吸道微生物样本进行了大规模宏基因组测序，并构建了微生物基因和基因组集。通过对BECs进行体外感染、免疫组织化学、VF分析和RNA测序，我们进一步阐明了猪肺炎支原体黏附导致纤毛损伤和上皮完整性破坏的机制。据我们所知，这项研究提供了第一个猪下呼吸道微生物组的微生物基因和基因组集，并为不同的猪肺炎支原体菌株在肺部疾病中的作用机制提供了新的见解。

虽然有一些研究报道了猪肠道菌群的基因集，但据我们所知，目前还没有关于猪呼吸道菌群这方面的研究报道。对于人类，Dai等利用健康儿童和肺炎支原体感染儿童的样本构建了包含230万个基因的呼吸道微生物基因集。对下呼吸道菌群进行宏基因组测序分析的研究更少。这主要是由于以下原因：1）下呼吸道结构复杂，采集微生物样本较为困难。上呼吸道菌群的污染风险较高。2）由于下呼吸道菌群的生物量较低，难以获得足够的DNA进行二代测序。更重要的是，宿主DNA污染的比例很高（超过90.0%）。这导致直接测序只能获得少量有效的微生物测序数据。本研究通过分离猪屠宰后胸腔内的肺和气管，获得气管灌洗液和BALs样本。这有助于避免上呼吸道微生物群的污染。采集实验样本的时设置空白和对照样本并同时进行测序。结果显示，污染不太可能对观察到的微生物组产生实质性影响。通过将测序深度大幅提高至平均每个样本70.3 Gb（图S1A），并使用广泛的样本来源，我们获得了空前数量的具有高度多样性和代表性的微生物基因（超过1,030万个）。

一些研究调查了猪肺部微生物群落的组成。然而，这些研究大多基于16S rRNA基因测序，只能在低分辨率的分类水平上描述微生物的组成。与我们之前使用16S rRNA基因测序的报道一致，普雷沃氏菌属、链球菌属和支原体属是下呼吸道微生物组的优势菌属。Ma等基于16S rRNA基因测序对健康猪和患病猪的肺部微生物组进行了比较分析，发现健康猪和患病猪之间存在不同的细菌群落。同样，Siqueira等也通过鸟枪法宏基因组测序发现，猪肺炎支原体、猪鼻支原体、猪链球菌、G. parasuis和E. coli在健康猪的肺微生物组中高度丰富。下呼吸道微生物组的组成受宿主遗传、年龄、环境和饲料等多种因素的影响。例如，之前的一项研究表明，包括土壤、空气、水和饲料在内的环境因素应该塑造猪肺的微生物群落，其中空气中的细菌占最大比例。在这项研究中，5个猪群体的肺微生物群的不同组成可能归因于环境、饮食和宿主遗传的差异（品种）。所有F7猪在相同的环境条件下，用标准商品饲料在未成形的农场环境中饲养。虽然本研究也使用了巴克夏×里岔杂交群体猪、藏族猪和二花脸猪，但这3个猪品种在不同的养殖场饲养，饲料也不同。品种、养殖环境、饮食和地理位置的综合影响使区分每个因素对下呼吸道微生物组组成的影响变得复杂。

MAGs的构建显著增加了微生物基因组的数量。该方法可用于菌株特异性基因组信息的获取。猪肺炎支原体是一种呼吸道病原体，在猪下呼吸道菌群中表现出较高的丰度，可引起地方性肺炎，并给养猪场造成相当大的经济损失。之前的一项研究揭示了基于16个选定基因的猪肺炎支原体菌株的遗传变异，但尚未进行全基因组研究。在本研究中，我们首次报道了猪呼吸道微生物组中猪肺炎支原体菌株的遗传多样性。在目前的参考基因组中，有多达30.0%的基因功能未知，与此一致，许多泛基因无法与COG分类和KEGG通路匹配。此外，大多数泛基因也具有菌株特异性。与NCBI RefSeq数据库中23个猪肺炎支原体基因组相比，本研究中重建的猪肺炎支原体MAGs在系统发育树中分布更广泛（图5B）。这些结果表明，猪肺炎支原体菌株具有高度的遗传变异。我们提供了大规模的猪肺炎支原体基因组资源，以促进在菌株水平上研究猪肺炎支原体在呼吸系统疾病中的作用。

肺部菌群α多样性随肺部病变严重程度降低而降低。在人肺微生物组中，高的微生物多样性对维持微生态系统的稳态具有有利作用，而低的微生物多样性与肺炎的临床特征相关。猪肺炎支原体的相对丰度与SVLL组中10种细菌的相对丰度呈负相关（图4D）。与此一致，之前的一篇报道表明，猪肺炎支原体可以通过直接竞争人类呼吸道微生物组来降低其他细菌的丰度。通过16S rRNA测序，我们之前发现支原体属与肺病变相关。在本研究中，猪肺炎支原体的相对丰度随着肺部病变的严重程度显著增加。7株猪肺炎支原体MAGs与F7猪的肺部病变和巴克夏×里岔杂交群体猪在不同的显著性水平相关。这一结果提示了猪肺炎支原体菌株在肺部病变中的作用，并揭示了菌株间的致病性差异。猪肺炎支原体是一种附着在纤毛和上皮表面的病原体，定植于宿主，导致纤毛损伤和丢失，甚至上皮细胞死亡。本研究中的体外感染实验证实了猪肺炎支原体对BEC纤毛丢失和上皮细胞屏障破坏的影响，但这些影响的严重程度在菌株之间存在差异（图6）。VFs帮助病原体快速适应环境的变化，并改善病原体对宿主细胞的黏附和侵袭。它们还帮助病原体逃离宿主的先天和适应性免疫系统。先前的研究表明，黏附素蛋白与猪肺炎支原体的致病性相关。然而，我们没有观察到不同菌株之间的VFs组成的显著差异。我们确实检测到编码黏附素和免疫逃避相关基因的VFG在高致病性（MAG47_like）和低致病性（168L）菌株之间以及与纯培养的差异表达。与我们的观察结果一致，比较基因组学和蛋白质组学还显示，致病和非致病的猪肺炎支原体菌株几乎共享它们所有已知的黏附素，而它们黏附能力差异的可能解释之一可能是转录水平的差异。通过RNA测序对不同致病性猪肺炎支原体感染的BECs进行DEG分析。猪肺炎支原体感染引起的免疫炎症反应、氧化应激和细胞凋亡相关基因表达水平升高与既往报道一致，提示猪肺炎支原体引起纤毛丢失和上皮完整性破坏的机制。

感染猪肺炎支原体的猪和感染肺炎支原体的人均表现出肺部炎症和疾病。然而，没有证据表明这两种细菌病原体在人与猪之间存在跨物种感染。这两种细菌属于两个不同的科，它们之间有明显的遗传距离。尽管如此，我们在猪肺炎支原体和肺炎支原体基因组中发现了与两种病原体黏附宿主细胞相关的VFG，且存在率较高。此外，我们观察到高比例的共享KOs。结合人感染肺炎支原体肺炎和猪感染猪猪肺炎支原体肺炎的肺微生物组系统发育组成高度相似的结果，提示两者引起肺部疾病的致病机制相似。这些结果表明猪可作为研究肺炎支原体引起人类肺部疾病的致病机制的动物模型。

结  论

总之，我们构建了一个包含空前数量的10,031,593个微生物基因（PRGC90）的非冗余基因集，并从猪下呼吸道微生物组中重构出了356个非冗余MAGs。利用这些数据，我们发现猪下呼吸道微生物组在个体间的异质性。我们分析了泛基因组，并调查了猪肺炎支原体菌株中VFs的分布。更重要的是，我们证实了猪肺炎支原体黏附对BEC纤毛缺失和上皮完整性破坏的影响，并阐明了可能的机制。然而，本研究存在一些局限性。首先，虽然我们进行了高深度宏基因组测序，但由于宿主DNA污染比例高，每个样本平均只获得了1.52 Gb的有效数据。这使得我们不得不进行共组装方法来获得更多高质量的contigs，也直接影响了预测基因和构建MAGs的完整性。此外，相对较小的有效数据也限制了低丰度微生物物种的捕获。因此，降低了猪下呼吸道菌群的总体多样性。第二，我们在整个实验过程中尽量避免污染。然而，与人类手术或支气管镜检查中使用的无菌条件相比还远远不够。本研究结果为猪下呼吸道微生物的研究提供了重要的资源，有助于肺部疾病的诊断和治疗。

方  法

实验动物和样本采集

本研究的研究对象包括来自一个镶嵌群体的618头猪、巴克夏×里岔杂交系的28头个体、11头藏猪、9头二花脸猪和9头野猪（表S1）。采用4个西方品种（杜洛克、长白猪、大白猪和皮特兰）与4个中国品种（巴马香、二花脸、莱芜和藏猪）杂交，构建嵌合体群体。所有试验猪均在江西省南昌市实验猪场在统一的室内条件下饲养。试验猪在15日龄接种猪瘟疫苗和猪圆环病毒ⅱ型疫苗，24日龄接种链球菌病疫苗和伪狂犬病疫苗，32日龄接种口蹄疫疫苗，40日龄接种猪繁殖与呼吸综合征病毒和副猪嗜血杆菌疫苗。618头F7猪在240日龄时进行屠宰，采用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）采集到687份样本，其中支气管肺泡灌洗液（BAL）样本613份，气管灌洗液样本74份。选取江西定南某商品养殖场饲养的巴克夏×里岔杂交的28头猪进行屠宰，获得28份BAL样品。从四川甘孜地区最初半自由饲养的11头藏猪采集BAL样本；这些猪随后被转移到南昌的一个养殖场，饲养一到三个月。本研究还纳入了9头二花脸猪的BAL液样本。这些二花脸猪是在江苏常州的一个猪场饲养的。对巴克夏×里岔杂交系、藏猪和二花脸猪进行了类似的接种疫苗程序。本研究从江西省山区捕获的野猪中采集了9份BAL样本。所有实验猪在整个饲养期间详细记录健康状况，并在采集样本前2个月未接受任何抗生素或益生菌治疗。采用几种方法尽可能地控制可能的污染：1）为每个样本分别准备无菌PBS和50 ml无菌离心管，并无菌仔细地保存。2）从胸腔取出后，立即将肺放置在干净的地方进行灌洗。3）所有操作人员均佩戴口罩和一次性医用手套。将无菌PBS注入肺内，在轻柔地揉捏肺部两分钟后，我们回收灌洗液体，避免接触任何其他材料。在屠宰后30 min内，从每个肺收集约45-50 ml PBS灌洗液体。选择同批次经过相同采样过程但不用于灌洗的PBS作为空白对照。所有样本均在1小时内放置在冰上带回实验室。PBS灌洗液在4℃和4000 × g的条件下离心30 min。随后将灌洗沉淀转移到2 ml无菌管中，并在-80℃保存，直至提取DNA用于后续分析。

肺部病变表型测定

猪呼吸系统疾病被认为是生猪生产中最重要的健康问题。然而，猪呼吸系统疾病的诊断往往具有挑战性，应结合屠宰场对肺部病变的评估。屠宰时，肺部病变程度可 作为评价肥育猪肺部疾病的重要性状。本研究采用评分系统对实验猪的肺部病变进行评估。简而言之，使用数码相机拍摄每个肺的前后视图。随后，使用我们前期研究中详细描述的方法和评分标准：（Ⅰ）将肺前部分为左、右尖叶，左、右心叶，左、右膈 6个部分，对各肺的病变程度进行评分。将肺后部分为左、右尖叶、左、右心叶、左、右膈叶、副叶7个部分（图3）。每个部分评分0-5分，对应病变面积占比：0%（0分）、0-20%（1 分）、20-50%（2 分）、50-75%（3 分）、75-90%（4分）、>90%（5分）。（Ⅱ）根据每个部分的面积赋予不同的权重。左、右尖叶、左、右尖叶、左、右膈叶、副叶的权重分别为20%（左右各10%）、20%、50%、10%。最后以前肺的总评分× 50% +前肺对应的后肺6个面的总评分× 50% + 副叶评分作为 每头实验猪肺部病变的最终评分。6名经验丰富的专业人员经过适当的培训后参与评分，然后选出两两相关系数最高（>0.8）的 3个评分结果，其平均分作为该个体的肺部病变评分。如果满足要求的评分结果少于3名小组成员，则必须进行重新评分。将最终评0-0.75分为健康肺组（HL），0.75-1.50分为轻度肺病变组（SLL），1.5-3.00分为中度肺病变组（MLL）；大于3分的为严重肺部病变组（SVLL）。对总共675头实验猪进行了表型测定。

猪繁殖和呼吸系统综合征病毒（PRRSV）抗体测定

血液样本在屠宰过程中被收集到促凝管中，将血液样本在3000 × g和4℃的条件下离心30 min，以提取血清。采用美国IDEXX公司生产的PRRS X3 Ab ELISA试剂盒（（IDEXX, USA））检测血清中PRRSV的IgG抗体。

微生物DNA提取和宏基因组测序

使用QIAampDNA提取试剂盒（Qiagen，德国）按照制造商的提取说明书从灌洗液沉淀中提取微生物DNA。在实验室处理前，所有的提取程序都是在紫外线处理后的无微生物DNA条件下在超净工作台（Esco Lifesciences，新加坡）中进行。采用NanoDrop-1000和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样本的浓度和质量。使用VAHTS通用DNA文库构建试剂盒（Vazyme，中国）按照说明书进行宏基因组测序文库的构建。简而言之，DNA样本通过超声处理随机打断到300 bp大小。然后，DNA片段被末端校正并在3'末端接上碱基A尾。将接头连接到片段末端进行PCR扩增。纯化后，所有文库在DNBSEQ-T7平台（BGI，中国）进行150 bp的双端测序。为了研究样品采集和测序过程中可能引入的污染，我们收集了6个无菌PBS样品作为空白背景对照，以及6个用于建库和测序的混合试剂样品作为测序背景对照样本。对12例对照样本进行高通量测序。由于从空白样本中获得的DNA浓度远远不够建库，因此将DNA样本浓缩，以获得足够的浓度进行建库和测序。

宏基因组测序序列组装

使用fastp（v0.20.1）（--cut_by_quality3 -W 4 -M 20 -n 5 -c -l 50 -W 3）软件将接头和低质量序列从原始数据中过滤。随后，使用Bowtie2（v2.3.5.1）软件在默认参数下将reads比对到猪参考基因组（Sscrofa11.1），从而去除宿主基因组DNA序列污染。MEGAHIT（v1.2.9）（--min-contig-len 500）软件用于744个宏基因组测序数据的共组装。我们同样使用MEGAHIT并用共组装相同的参数进行744个宏基因组测序数据的单样本组装。

微生物基因集的构建

在Prodigal（v2.6.3）中使用参数“-p meta”对来自共组装和单样本组装的contig进行基因预测并翻译成蛋白质序列。保留基因长度≥100bp的基因作一步分析，长度<100bp但包含完整的开放阅读框（含有起始密码子和终止密码子）也被保留。使用CD-HIT（v4.8.1）按照UniRef指南在氨基酸序列同源性为100%（PRGC100）、90%（PRGC90）和50%（PRGC50）的情况下在蛋白质水平上对所有基因进行聚类。基于Uniprot TrEMBL数据库（https://www.uniprot.org/statistics/TrEMBL）的比对情况，将属于真核生物（真菌和原生生物除外）的基因去除掉，不纳入构建的基因集中。

基因的分类和功能注释

使用DIAMOND（v2.0.12.150）比对软件，以e-value ≤ 1 × 10^-5为阈值，在Uniprot TrEMBL蛋白数据库中对基因集中的基因进行物种分类注释。未与数据库比对的蛋白质被定义为未知蛋白质。对于DIAMOND输出中有多个记录的基因，其分类注释基于BASTA（v1.3.2.3）中的最低共同祖先算法确定。类似地，未被分配到任何分类群的蛋白质被定义为未知分类群。使用eggNOG mapper（v2.6.1）将基因与eggNOG数据库（v5.0）进行比对，对eggNOG同源基因和COG功能分类进行注释。使用KOBAS（v3.0.3）（-t blastout:tab, -s ko）软件得到KEGG同源簇注释结果。使用HMMER（v3.1b2）将基因集中的基因与dbCAN2数据库（HMMdb V10）进行比对，获得碳水化合物活性酶（Carbohydrate-active enzymes, CAZymes）注释。通过BLAST（v2.12.0）将基因的蛋白质氨基酸序列与毒力因子数据库（Virulence Factor Database, VFDB）进行比对获得毒力因子注释。通过与VFDB和Uniprot TrEMBL蛋白数据库的比对来确定毒力因子基因（virulence factor gene, VFG）的宿主细菌。如果一个基因序列同时比对到一个VFG和一个微生物物种分类，我们认为该微生物物种分类是该VFG的宿主细菌。VF类型是指由同一种VFG编码的一类毒力因子。MAGs的功能注释步骤与基因集注释相同。对于所有蛋白质序列的功能比对，我们选择了评分最高的注释序列用于后续分析。为了比较肺炎支原体肺炎患者和猪肺炎支原体感染猪之间肺微生物组的微生物组成，我们下载了46个肺炎支原体肺炎儿童BAL样本的宏基因组测序数据集。人类肺部样品和阴性对照样品的宏基因组原始数据处理、组装、构建非冗余基因集、分类注释、丰度计算等步骤与本研究宏基因组测序数据相似（除了在去除宿主DNA这一步骤将参考基因组改为人的参考基因组（GRCH38））。

宏基因组binning

MetaBAT2（v2.15），Maxbin2（v2.2.7）和CONCOCT（v1.0.0）被用于从单个样本组装的contigs中组装基因组。利用MetaWRAP（v1.3.2）的Binning_refiner模块对三个程序获得的bins集和进行组合和提纯。使用CheckM（v1.0.18）评估bins的质量。完整性≥50%且污染率≤10%的MAGs被保留用于后续分析。为了提高MAGs的质量，我们使用metaSPAdes（v3.13.0）和MetaWRAP的Reassemble_bins模块将比对到MAGs的宏基因组测序reads进行了重组装。为了获得更多的MAGs，并且考虑到去除宿主基因组DNA污染后测序深度较低，本研究还采用了co-binning策略。MetaBAT2（v2.15）、Maxbin2（v2.2.7）和VAMB（v3.0.2）应用于co-binning并与单样本binning一样进行了bin的提纯和重组装。使用dRep（v3.2.2）对所有MAGs进行去重复，并在99%平均核苷酸相似性（average nucleotide identity, ANI）（菌株）和95% ANI（种水平基因组，species-level genome bins（SGBs））的阈值下进行聚类。基于基因组分类数据库（GTDB, https://gtdb.ecogenomic.org/），使用GTDB-tk（v2.1..0）对MAGs进行物种分类注释。包含GTDB中至少一个参考基因组的SGB被认为是已知的SGBs，而不能与GTDB中任何参考基因组匹配（与GTDB数据库中的参考基因组ANI值小于95%）的SGBs被定义为未知的SGBs（unknown SGBs, uSGBs）。MAGs的基因组注释使用Prokka（v1.13）在默认参数下进行，但支原体和脲原体属的MAGs注释被设置选项“-gcode 4”，因为在来自支原体和脲原体的细菌中使用第4套遗传密码，将通常的UGA终止密码子翻译成色氨酸。

基因、物种分类、功能和MAGs丰度的计算

使用BWA MEM2（v2.2.1）将每个样本的有效reads比对到基因集中。使用Samtools（v1.7）将SAM文件转换为BAM文件并进行排序。通过FeatureCounts（v2.0.1）计算成功比对的reads数量。每个样本中各基因的相对丰度计算公式如下：

其中，对于基因i，N_i 为比对上基因i的reads数，L_i为基因i的序列长度，n为每个样本的基因数。物种分类和功能分类的相对丰度由物种分类单元和功能分类的基因相对丰度之和计算而来。通过metaWRAP（v1.3.2）中的Quant_bins模块计算每个样本中的MAGs丰度。

猪肺炎支原体菌株的PacBio HiFi测序

猪肺炎支原体菌株（AH、JS-266、JS-C1、NJ、WX和XLW-2）由江苏省农业科学院（江苏省南京市）兽医研究所提供，在37℃ KM2培养基中培养。从培养基中获取对数生长期的猪肺炎支原体细胞。采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取6株猪肺炎支原体高分子量基因组DNA，用Grandomics基因组试剂盒（Grandomics，中国）进行纯化。采用SMRTbell Prep Kit（v3.0）构建PacBio HiFi测序文库。根据制造商的说明书，在PacBio Revio平台上对文库进行测序。采用CCS软件（https://github.com/PacificBiosciences/ccs）从原始测序数据中生成质量大于Q20的高精度HiFi测序数据。每个样本共获得1 Gb（1.8 ~ 3.9）的HIFI数据。这些HIFI reads使用metaFlye（v2.92 -b1786）（-pacbio-hifi –meta –scaffold）和hifiasm_meta（v0.3-r073）进行全基因组组装。用CheckM（v1.0.18）软件对组装后的基因组进行质量评价。我们获得了6株菌株的全基因组序列，都是只包含一条组装成环的contig。

系统发育分析

利用PhyloPhlAn（v3.0.60）构建了基于400个通用标记蛋白的系统发育树，参数为“—diversity low—min_num_marker 50”。利用Roary （v3.12.0, -e -z -i 95 -cd 95 -t 4）测定的393个核心基因（存在于超过95.0%的基因组中），用PhyloPhlAn构建了291株猪肺炎支原体基因组的系统发育树。参数设置如下：“--diversity low --trim greedy --remove_fragmentary_entries”。使用iTOL（v6.5.2）和GraPhlAn（v1.1.3）分别可视化356个MAGs和291个猪肺炎支原体基因组的系统发育树。

猪肺炎支原体的泛基因组分析

本研究共构建的262个MAGs，来自不同猪群分离株的6个基因组和从NCBI RefSeq数据库下载的23个猪肺炎支原体基因组用于泛基因组分析。符合以下标准的MAGs被保留用于进一步分析：0.7 Mbps<基因组大小<1.1 Mbps（从NCBI RefSeq存储库下载的23个猪肺炎支原体基因组的大小范围为0.8 ~ 1 Mbps），包含<500个contig，>90.0%的完整性和<5.0%的污染。最后，所有291株猪肺炎支原体基因组均通过了质量控制，并被用于泛基因组分析。然后使用Prokka（v1.13，--gcode 4）来注释这些基因组。用Roary软件分析注释后的基因组，将存在于超过95.0%基因组中的基因定义为核心基因，并进行系统进化分析。根据PhyloPhlAn产生的核心基因进行多序列比对，使用R（v4.1.2）中的rihierbaps（v1.1.3）包定义亚分支。基因组间的ANI值使用FastANI（v1.32）计算。利用R中的cmdscale函数，基于两两ANI距离矩阵进行经典多维尺度（MDS）分析。

两株纯培养的猪肺炎支原体菌株的RNA测序

收取对数生长期的两株猪肺炎支原体（MAG47_like和168L）的培养细胞。根据说明书，使用RNA快速纯化试剂盒（UU-bio Technology，中国）从细菌细胞中提取总RNA。选取RNA integrity number（RIN）≥7、OD260/280 = 1.8 ~ 2.0、OD260/230≥2.0的RNA样本构建文库。使用TIANSeq rRNA清除试剂盒（细菌）（TIANGEN，中国）去除核糖体RNA。根据Optimal Dual-mode mRNA Library Prep 试剂盒（BGI，中国）构建cDNA文库。利用MGISEQ-2000（BGI，中国）平台对文库进行2×150 bp的双端测序。

两株猪肺炎支原体菌株的体外感染实验

按照之前的报道，我们从35日龄无特殊病原体幼猪的支气管中分离出猪支气管上皮细胞（BECs），并在气液界面（ALI）培养系统中培养，该系统模拟体内气道上皮的自然条件，与自然组织接近。当至少80.0%的ALI-BEC表面出现波浪状纤毛时，认为细胞分化良好。分化的ALI-BECs在感染前不使用抗生素维持1日，用PBS洗涤3次，并在37℃孵育4 h，使黏液聚集至接近完整气道的深度。用100 μl的Hanks’ balanced salt solution （HBSS）将约10⁷ 颜色改变单位（CCUs）（multiplicity of infection = 20）的MAG47_like和168L的猪肺炎支原体接种在ALI-BECs的滤器顶端。仅接种HBSS的细胞作为阴性对照。将猪肺炎支原体菌株和BECs在37℃和5.0% CO2的湿化条件下中共同孵育24 h以感染。为了量化黏附的细菌，感染细胞和对照细胞用PBS洗涤3次以去除未黏附的细菌细胞。

猪肺炎支原体黏附的免疫荧光测定（IFA）

如先前报道所述，使用双免疫荧光显微镜检测黏附的猪肺炎支原体细胞。用1.0%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭细菌细胞膜30 min后用一抗和二抗孵育。使用的一抗是抗猪肺炎支原体的小鼠抗体（1:100稀释度）（由江苏省农业科学院生产）和Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG（1:400稀释度）（Beyotime Biotech，中国）。以Cy3-conjugated goat anti-mouse IgG（1:400稀释度）（Beyotime Biotech，中国）作为二抗。为了检测细菌细胞表面的β-tubulin，在封闭后，用PBS洗涤细胞，并与抗β-tubulin的一抗（1:200稀释度）（Novus Bio， USA）在1.0% BSA中孵育，在2 ~ 8℃过夜。然后，洗涤细菌细胞，用Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔IgG（1:400稀释度）（Beyotime Biotech，中国）孵育1 h。所有细胞进一步用2,4-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Beyotime Biotech，中国）染色5 min，并在室温下用PBS洗涤。采用UltraView VoX激光扫描共聚焦显微镜（PerkinElmer，USA）对细胞进行成像。

定量PCR测定黏附的猪肺炎支原体的数量

使用TIANamp Bacteria DNA试剂盒（TIANGEN，中国）从ALI培养系统下室的0.2 ml培养基中提取猪肺炎支原体DNA。提取的DNA采用TaqMan实时荧光定量PCR方法进行定量。引物和TaqMan-BHQ探针是根据猪肺炎支原体P97基因的保守序列设计。在Applied Biosystems 7500 real-time PCR系统中使用以下循环参数执行定量PCR: 50℃2 min；95°C 10 min；以及95℃15 s和60℃1 min的40次循环。

扫描电镜观察BEC纤毛的损伤

将含有BECs的滤膜在PBS中洗涤，并在0.1 M磷酸盐缓冲液中固定在2.5%戊二醛中（pH = 7.4）。用分级丙酮系列脱水标本并在六甲基二硅氮烷（HMDS）溶液（Sigma-Aldrich）中干燥。使用精密蚀刻和涂层系统（Gatan France，法国）的离子束涂层器在干燥的样品上涂上一层薄铂，然后使用Zeiss Ultra Plus field emission gun scanning electron显微镜（FEGSEM，法国）观察。

跨上皮电阻（TEER）测量

为了评估上皮细胞屏障的完整性，TEER使用Millicell-ERS（电阻系统）（Millipore，法国）测量。于24 h时，在插入片顶端加入500μl培养基，测定各插入片的TEER。在测量每次培养的TEER前，以空培养为对照背景，计算TEER值为（测量值-背景值）。

猪肺炎支原体菌株和感染的BECs的双RNA测序

从江苏省农业科学院（江苏省南京市）兽医研究所获得猪肺炎支原体分离株MAG47_like和168L，在建立的ALI培养体系中，以MOI 20:1感染BECs 24 h。培养24 h后收集未感染细胞和感染细胞。TRIzol法提取总RNA。使用TIANSeq rRNA去除试剂盒（细菌）和TIANSeq rRNA去除试剂盒（H/M/R）（天根，中国）去除原核和真核rRNA。使用Optimal Dual-mode mRNA Library Prep Kit（BGI，中国）构建cDNA文库。简而言之，通过添加片段缓冲将无rRNA的RNA样本片段化至200-600 nt。cDNA第一链的合成采用Strand Specificity Reagent and 1st Strand Enzyme Mix（BGI，中国）。然后通过添加第二链缓冲液（dUTP）和2nd Strand Enzyme Master Mix（BGI，中国）来合成第二链。反义cDNA的5 ‘端连接到3 ’端。使用BGI Plug-In Adapter试剂盒（BGI，中国）进行cDNA扩增。利用MGISEQ-2000（华大基因，中国）平台对构建的文库进行2×150 bp的双端配对测序。

通过Fastp（v0.23.2）去除低质量和接头序列，对原始序列进行初始修剪。使用默认设置的SortMeRNA（v4.3.6）去除所有rRNA序列。使用Bowtie2（v2.4.5）分别与猪参考基因组（Sscrofa11.1）和猪肺炎支原体基因组（Accession Nos. GCF_021383865.1和GCF_000400855.1）进行比对，收集宿主和细菌的reads。我们首先使用STAR（v2.7.11a）将宿主序列比对到猪参考基因组（Sscrofa11.1），然后将SAM格式转换为BAM格式，并使用SAMtools（v1.15.1）序列进行排序。然后使用StringTie（v2.2.1）进行基于比对的转录本组装。使用featureCounts（v2.0.1）对每个样本的基因表达进行定量。对于猪肺炎支原体序列，使用Bowtie2（v2.4.5）将有效序列比对到猪肺炎支原体的参考基因组序列。然后使用featureCounts （v2.0.1）对每个样本的比对上的序列进行量化。差异表达基因（DEGs）通过DESeq2（v1.34.0）R包进行鉴定。为了识别差异水平位于前500位的DEGs所富集的KEGG通路，我们使用Cytoscape插件ClueGo进行富集分析。

统计分析

基因集中预测基因数量的累积曲线在每个抽样间隔自举重复10次。使用R stats包中的SSasymp和nls函数进行渐近回归。采用线性判别分析效应量（LEfSe）分析（v1.1.01），以|LDA|>2为阈值，识别F7猪中不同肺部病变严重程度组间以及在巴克夏×里岔杂交猪群体中健康猪与肺部病变猪之间富集程度不同的MAGs、VFs和KEGG通路。使用R中的vegan（v2.5-7）包计算肺部微生物组成的α多样性指数（包括观察物种和Shannon指数）和基于Bray-Curtis距离的β多样性度量。主坐标分析是基于Bray-Curtis距离在R的vegan包进行的。采用Wilcoxon检验比较不同肺部病变程度猪组间α多样性和肺微生物组成的差异。基于细菌物种相对丰度的Spearman秩相关构建了27种细菌的共现性网络。p值是基于999种排列计算的。相关系数>0.3和p<0.05的细菌物种间的相互作用才呈现在共现性网络中。共现性网络在Cytoscape （v3.9.1）中进行可视化和注释。

作者简介

李井泉（第一作者）

● 江西农业大学猪遗传改良与种质创新全国重点实验室已毕业博士研究生。

● 研究方向为肺部微生物与宿主互作，以第一作者（含共同）在iMeta、Nature Communications和International Microbiology期刊发表SCI论文3篇。

黄菲（第一作者）

● 江西农业大学猪遗传改良与种质创新全国重点实验室已毕业博士研究生。

● 研究方向肺部微生物与肺部单细胞转录组，以第一作者（含共同）在iMeta、Nature Communications期刊发表SCI论文2篇。

周云燕（第一作者）

● 江西农业大学猪遗传改良与种质创新全国重点实验室已毕业博士研究生，2022年入职浙江工业大学。

● 研究方向为肠道和呼吸道微生物组研究及抗生素耐药性。以第一作者（含共同）或通讯作者在Nature Communications（2篇）、Microbiome和iMeta等期刊发表论文7篇，其中一区Top论文5篇（包括IF>10分4篇，ESI高被引1篇）。作为主要参与者获江西省科学技术进步特等奖1项，主持国家自然科学青年基金等科研项目4项。曾获省优秀博士学位论文、肠道领域的热心肠奖学金三等奖、校优秀毕业研究生等荣誉，2023年入选浙江工业大学高层次人才（C类）培育对象。

黄路生（通讯作者）

● 中国科学院院士，发展中国家科学院院士，俄罗斯科学院外籍院士，江西农业大学教授，博士生导师，中国畜牧兽医学会理事长，国家畜禽遗传资源委员会主任，德国哥廷根人文与科学学院通讯院士，德国洪堡学者，国家杰出青年基金获得者，全国杰出专业技术人才，猪遗传改良与种质创新全国重点实验室主任。

● 研究方向为家猪的遗传育种。在猪重要经济性状的遗传机制解析及其分子育种的基础研究、技术创制、产品创造中取得了国际领先水平的系统性创新成果。全面研究了欧美商业猪种及中国地方猪种生长、繁殖、体型、毛色、抗病和肉质性状的种质遗传特性，并阐明了家猪脊椎数量、肉的品质、胴体长度、抗病能力、毛色、骨骼长短等经济性状的遗传机制，是国际上发现并鉴别家猪质量性状及复杂数量性状因果基因及其因果突变最多的专家。创建的大体格、多排骨、雪花肉、抗病力强基因育种技术获国际发明专利，达国际领先水平并对民族企业全部免费无偿使用，对国家种业破卡发挥了重要作用。在基础研究上，组装了世界领先水平的分相、无盲区家猪基因组；以通讯作者身份发表中国畜牧学科目前唯一《Nature》研究长文。在技术创制上，研发的家猪育种基因芯片“中芯1号” 国际领先，并在全国所有24个生猪主产省份推广应用，成为国家生猪种业“破卡”的主流技术技术保障。在产品创造上，培育的中系大体格山下长黑猪综合生产性能处于国际先进水平。2020年获全国先进工作者（全国劳模）、全国创新争先奖。以第一主持人身份，获何梁何利基金科学与技术进步奖、国家技术发明二等奖、国家科技进步二等奖以及江西省科学技术特别贡献奖、江西省自然科学一等奖、江西省技术发明一等奖、江西省科技进步一等奖等国家以及省部级奖励10项。以通讯作者在Nature, Nature Genetics, Nature Communications, Microbiome等重要学术刊物发表研究论文200余篇。是国际知名动物基因组及遗传育种学家。

陈从英（通讯作者）

● 江西农业大学研究员，博士生导师。

● 研究方向为猪肠道菌群与宿主基因互作。先后主持国家自然科学基金5项、国家重点研发课题1项，参与国家级科研项目10余项。累计发表学术论文60余篇，其中以第一作者或通讯作者在Nature、Nature Communications、Microbiome、iMeta和Gut Microbes等SCI刊物上发表论文40多篇。

艾华水（通讯作者）

● 江西农业大学研究员，博士生导师。

● 研究方向包括两个：1）应用生物信息学技术进行动物遗传资源利用和保护研究；2）应用系统生物学技术解析家畜复杂性状（如适应性、抗病等）的遗传机理研究。江西省青年科学家培养对象，江西省新世纪“百千万”人才工程人选。先后主持省级及省级以上课题7余项，其中国家自然科学基金3项。先后发表学术论文30多篇，其中以第一作者或通讯作者在Nature Genetics、Molecular Biology and Evolution、iMeta和Genomics, Proteomics & Bioinformatics等SCI刊物上发表论文20多篇。